### 培养条件

培养条件为气相95%空气和5%二氧化碳，温度设置在37℃。使用的培养基为DMEM，添加10% FBS和1% P/S。A-673细胞系来源于一名15岁女性患者的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂上形成克隆，并在接受免疫抑制血清处理的小鼠中具备成瘤能力。这一细胞系有超过四条特征染色体，此外还有一条额外的F染色体及两条异常的B染色体。

传代方法方面，首次建议采用1:2的传代比例。培养时，请在细胞状态良好后，灌满完全培养液并封好瓶口，这样能够有效保障运输过程中细胞的存活。

#### 细胞处理和培养

收到细胞后，首先使用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后将其放入超净台内，确保无菌操作。接着将细胞瓶放入37℃且5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以使细胞状态稳定，之后进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并采取不同倍数的照片保存（建议使用40x、100x和200x各一张）。前几天的照片可以作为重要的售后依据，若未提供照片则默认细胞状态良好。

#### 细胞传代步骤

1. **细胞传代：** 当细胞的汇合度未超过80%时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代培养。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 放弃培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次；

2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速加入超量的完全培养基以终止消化；

3. 轻轻吹打细胞，让其完全脱落后吸出并转移至15ml的离心管中，1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，并加入1-2ml完全培养基重悬。

4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（如两个T25瓶），然后补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

2. **悬浮细胞传代：** 可采用半换液法和离心换液法。使用半换液法时，让培养瓶竖着静置一小时，轻轻吸掉3ml培养基并补给3ml完全培养基；如需分瓶，则可收集细胞悬液至离心管中，1000RPM离心5分钟后，将上清弃去并补加1-2ml培养基进行重悬，最后按1:2的比例分瓶。

#### 细胞冻存与复苏

1. **细胞冻存：** 细胞生长至瓶内面积覆盖80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞；接着添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变化，并在消化完成后加入5ml完全培养基以终止消化。然后将细胞转移至离心管中，离心5分钟清除上清；将沉淀细胞与雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001）混匀后加入冻存管中，最后将冻存管放入-80℃的冰箱保存。

2. **细胞复苏：** 从液氮中取出冻存管后，迅速放入37℃水浴中解冻，确保无结晶后，用75%酒精擦拭管外壁。将细胞转移至含5ml完全培养基的离心管中，离心5分钟，然后重悬并接种至T25培养瓶中，放入细胞培养箱中继续培养。

#### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因为贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。如果发现细胞脱落较多，可收集所有培养液至离心管中，进行离心和重悬，最后按比例分瓶传代（如两个T25），并将新的完全培养基添加至每瓶中，确保细胞能够良好生长。

ag尊龙凯时致力于为细胞培养提供最优质的解决方案，帮助研究者在细胞生物学研究中获得更好的成果。