将动物体内的各种组织提取出来后，通过不同的酶（如胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械方法进行处理，将其分散为单个细胞，并在适宜的培养基中进行培养，使细胞得以存活、生长与繁殖，此过程称为原代培养。原代细胞培养的步骤通常包括取材、分离和培养与维持。本文主要介绍原代细胞的取材和分离方法。

一、取材

动物和人类细胞的取材是原代细胞培养成功的关键因素，直接影响细胞在体外的生长效果。取材时需要注意以下基本要求：

• 确保取材新鲜并保持适当的保存状态
• 严格执行无菌操作
• 防止机械损伤
• 去除无用组织以避免干燥
• 关注组织类型、分化程度和年龄等因素
• 做好相关记录

各类组织的取材技术

1. 对于皮肤和粘膜组织，通常取自手术过程中切除的小片，面积一般为2至4平方厘米。
2. 内脏组织（除消化道外）基本无菌，取材时要明确所需组织的类型和部位，采集肿瘤时要选择细胞丰富的区域，避开块状坏死或液化部分，尽量去除多余的结缔组织。
3. 血液细胞的取材一般从静脉外周血或淋巴组织（如脾、扁桃体、胸腺和淋巴结等）中分离，取材时应注意抗凝。
4. 骨髓及羊水细胞的取材应在严格无菌条件下进行，并注意抗凝，尽快完成分离培养，离心后用无钙、镁的PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可进行培养。
5. 对于鼠胚组织的取材，需使用无菌操作，仔细解剖取出胚胎。
6. 鸡、鸭等鸟类胚胎组织的取材则需在孵化到适当的胚龄后进行，确保消毒与操作的无菌性。

二、原代细胞的分离

在动物或人类体内（尤其是胚胎组织），细胞紧密结合，不利于它们在体外的生长，因此需要将现有的组织块充分分散，解离出单个细胞。

1. 悬浮细胞的分离方法

对于来自血液、羊水或胸腹水等悬液样本，可以采用1000转/分钟的低速离心10分钟，利用不同细胞间的比重差异形成分层液，从中分离出目标细胞。

2. 实体组织的分离方法

对于实体组织，由于细胞间结合紧密，需要通过机械分散法和消化分离法进行处理：
1. 机械分散法简便快速，但易对组织造成损伤，适合于处理纤维成分少的软组织。
2. 消化分离法则是将组织剪切成小团块，利用酶的生化作用进一步解离细胞。在这一过程中，胰蛋白酶和胶原酶是常用的选择，能够有效分散细胞。
此外，EDTA作为一种非酶消化剂，能通过结合离子实现细胞的圆形化和分散，达到提高细胞分离效率的效果。

消化分离法的操作步骤

该操作包括剪切、添加培养液、漂洗、消化和弃去消化液等环节。每一步均需谨慎操作，尤其在漂洗时必须确保去除所有钙、镁离子，避免影响酶的活性。胰蛋白酶浓度和作用时间也需严格控制，以免对细胞产生毒性影响。

通过上述方法的科学实施，能够有效提升原代细胞的培养成功率，为后续的生物医学研究奠定基础。ag尊龙凯时致力于生物医疗领域，提供高品质的细胞培养和研究解决方案。