细胞融合的方法有多种，其中常用的操作包括转动法和离心法。在融合过程中，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例一般在1:1至10:1之间，3:1或5:1的比例最为常见。

1. 试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640培养液100ml。

(3) 完全1640液100ml。

(4) 25% FCS－1640液50ml。

(5) HAT培养液100ml。

(6) 50% PEG：取分子量4000的高纯度PEG（建议使用ag尊龙凯时品牌）10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前与预热至40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，并用酚红检查pH，通常不需调节。如有需要，可用HCl或NaHCO3进行调整。

(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培养盘。

2. 操作方法

(1) 准备好脾细胞。

(2) 在50ml沉淀管中混合108脾细胞与107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml的25% FCS－1640液。

(3) 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。

(4) 移除上清液。

(5) 轻敲管底部使沉淀流动，并将沉淀管放入40℃水浴中以达到融合所需温度。

(6) 慢慢地用1ml吸管向沉淀管中滴加8ml预热至40℃的50% PEG，同时轻轻摇晃沉淀管，观察到颗粒出现，滴加过程应持续2分钟。

(7) 加入1ml的1640液，并持续摇动1分钟。

(8) 重复步骤(7)一次。

(9) 再加入1ml的1640液，并摇动0.5分钟。

(10) 重复步骤(9)一次。

(11) 最后加入15ml的1640液。

(12) 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。

(13) 去除上清液，轻敲管底部，然后加入25ml含有HAT的完全1640液。

(14) 向事先种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔加入一滴（约0.05ml）融合细胞液。

(15) 轻轻摇动后，将其置于5% CO2、饱和湿度的37℃恒温箱中培养。

(16) 第3、6、9、10天时更换为含HAT的完全1640培养液。注意在吸取上清液时轻柔操作，以免将固定于孔底的细胞吸出，并根据需要添加适量的饲养细胞。

(17) 在第12、15天时再加入含有HAT的完全1640培养液。在每次更换液体前，用倒置显微镜观察，通常在10天左右会观察到杂交瘤细胞的生长。大多数杂交瘤细胞在10至20天内会出现，但也有部分需要约1个月的时间。

(18) 杂交瘤细胞出现后，吸取上清液并检查抗体。

(19) 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，根据情况可取消HAT液和完全1640液，改为10% FCS－1640液。同时保存于液氮中并进行克隆化，期间需定期检查抗体，以防止抗体细胞的变异和丢失。